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Neurogénesis en el Hipocampo Humano Adulto

(Neurogenesis in the adult human hippocampus)

Peter S. Eriksson1,4, Ekaterina Perfilieva1, Thomas Björk-Eriksson2, Ann-Marie Alborn1,
Claes Nordborg3, Daniel A. Peterson4 & Fred H.Gage4
 

Department of Clinical Neuroscience, Institute of Neurology1, Department of Oncology2, Department of Pathology3, Sahlgrenska University Hospital, 41345 Göteborg, Sweden4Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 10010 North Torrey Pines Road, La Jolla, California 92037, USA

La correspondencia debe ser dirigida a F.H.G.

La génesis de nuevas células, incluyendo las neuronas, no ha sido aún demostrada en el cerebro humano adulto. Este estudio fue emprendido para investigar si ocurre neurogénesis en el cerebro humano adulto, en regiones previamente identificadas como neurogénicas en roedores y monos adultos. El tejido de cerebro humano fue obtenido postmortem de pacientes que habían sido tratados con un análogo de la timidina, bromodeoxiuridina (BrdU), que marca el ADN durante la fase S. Utilizando marcación inmunofluorescente para la BrdU y para uno de los marcadores neuronales, NeuN, calbidina o enolasa neuronal específica (NSE), nosotros demostramos que neuronas nuevas, así definidas por estos marcadores, son generadas por división de células progenitoras en el girus dentado de humanos adultos. Nuestros resultados además indican que el hipocampo humano retiene su habilidad de generar neuronas durante toda la vida.

Se cree que la pérdida de neuronas es irreversible en el cerebro humano adulto porque las neuronas que mueren no pueden ser reemplazadas. Se piensa que esta incapacidad de generar células de reemplazo es una causa importante de enfermedad neurológica y deterioro. En la mayoría de las regiones del cerebro, la generación de neuronas está normalmente confinada a un discreto período del desarrollo. Son excepciones el girus dentado y la zona subventricular de varias especies donde se generan nuevas neuronas durante los períodos post-natal y adulto1-6. Neuronas granulares son generadas durante toda la vida por una población de células progenitoras en continua división que residen en la zona subgranular del girus dentado en el cerebro de los roedores5. Neuronas ‘recién nacidas’ generadas de estas células progenitoras, migran hacia dentro de la capa de células granulares, se diferencian, extienden axones y expresan proteínas marcadoras neuronales7-10.

Nosotros examinamos si las células progenitoras residen en el hipocampo humano adulto y si las neuronas nacen dentro del girus dentado del cerebro humano adulto. Tejido posmortem del hipocampo y de la zona subventricular del núcleo caudado fue obtenido de pacientes (n=5) con cáncer quienes recibieron una infusión intravenosa (250 mg; 2,5 mg/ml, 100ml) de bromodeoxiuridina (BrdU) con propósito de diagnóstico11. Un paciente diagnosticado con un cáncer de tipo y localización similar, pero sin tratamiento con BrdU, fue incluido como control. La BrdU, un análogo de la timidina, se incorpora al DNA de las células en división y puede ser detectado por inmunohistoquímica en su progenie5,12,13.

 

Génesis y supervivencia celular en el girus dentado del adulto humano

El número de progenitores proliferativos marcados que sobrevivieron fueron cuantificados usando tinción inmunohistoquímica de BrdU y contados por técnicas imparciales 14,15,16. Las células marcadas con BrdU fueron cuantificadas en la capa celular granular y en la zona subgranular del girus dentado y en el hilio (área CA4; Fig. 1a). En todos los pacientes tratados con BrdU, la capa celular granular contenía núcleos redondos a ovales BrdU positivos con la morfología típica del núcleo de las células neuronales granulares (Fig. 1b-d). La apariencia morfológica y la localización de estos núcleos eran similares a los de los núcleos de células halladas en el girus dentado del ratón, rata y mono marmoset adultos 5,6 17. No se pudo detectar un perfil inmunoreactivo en el paciente control quien no había recibido BrdU. La presencia de núcleos BrdU-positivos en una región del cerebro que es neurogénica en muchas otras especies de mamíferos y primates indica que células progenitoras neuronales proliferativas están presentes en el girus dentado del adulto humano.

El número de células BrdU-positivas en la capa celular granular, en la zona subgranular y en el hilio varió entre individuos, como podría ser esperado debido a la variedad de los intervalos post- infusionales y las diferentes edades de los pacientes (Fig. 2a-c). Hay una disminución aparente en el número de células que son detectadas en los pacientes que tuvieron los intervalos más prolongados entre el tratamiento con BrdU y la valoración histológica. Esta disminución podría indicar una muerte progresiva de las nuevas células generadas en el transcurso del tiempo. Sin embargo, las muestras pequeñas debilitan cualquier conclusión.

 

Las células marcadas con BrdU co-expresan marcadores neuronales

Para determinar el destino celular de las células inmunoreactivas marcadas con BrdU, nosotros hicimos una triple marcación inmunofluorescente para BrdU y marcadores celulares específicos, incluyendo la proteína glial acídica fibrilar (GFAP), un marcador para astroglia y uno de los marcadores neuronales, NeuN 18,19, calbidina o enolasa neuronal especifica 21 (NES). Se utilizó microscopía confocal para determinar el fenotipo de las células BrdU-positivas (Figs 3 y 4). No se halló ninguna evidencia de reactividad cruzada entre la inmunoreactividad de la GFAP y cualquiera de los tres marcadores neuronales en estas secciones. Procesos GFAP-inmunopositivos fueron observados en los alrededores de las neuronas y sus procesos pero no se observó co-expresión en las mismas células (Fig. 3e-h). En este tejido se observó autofluorescencia pero la emisión no específica causada por artefactos fue fácilmente detectada por su contribución a múltiples longitudes de onda (Fig. 3a-d). Nosotros tuvimos el cuidado de evaluar fuentes potenciales de autofluorescencia en el tejido humano mediante la toma de imágenes de secciones sin tratar y secciones del paciente control, en ambos casos con y sin el pretratamiento para la detección inmunohistoquímica de BrdU en ausencia de anticuerpos contra BrdU. La autofluorescencia se presentaba inclusive en secciones completamente no tratadas y se restringía al citoplasma de las células neuronalmente marcadas o a células endoteliales y células rojas sanguíneas y podían ser claramente distinguidas del perfil BrdU-inmunoreactivo (Fig. 3). La mayoría de las neuronas NeuN-positivas que presentaban doble marcación con BrdU estaban localizadas dentro o cerca de la capa celular granular y tenían las características morfológicas de las células neuronales granulares: núcleos redondos u ovales con cuerpo celular pequeño a mediano (Fig. 3). Los análisis Z-series de microscopía confocal de los núcleos BrdU-positivos identificaron sin ambigüedad la doble marcación con NeuN y demostraron la existencia de células neuronales granulares recientemente generadas (marcadas con BrdU) en el girus dentado del cerebro humano adulto (Fig. 3d-h). La expresión fenotípica de estas neuronas BrdU-positivas en el humano adulto fue equivalente a la expresión encontrada en roedores adultos 5,10,12,17 (Fig. 3i-l). El promedio de la fracción de células doblemente marcada BrdU-NeuN en la capa celular granular fue de 22.0 ± 2.4% en los pacientes tratados con BrdU.

Neuronas doblemente marcadas con BrdU y NSE también pudieron ser detectadas en todos los sujetos tratados con BrdU (Fig. 4e-f). El promedio de la fracción de células marcadas con BrdU que también estaban marcadas con NSE en la capa celular granulosa fue de 22.7 ± 2.8%. Las células doblemente marcadas por BrdU y calbindina también fueron observadas y apoyaron las evidencias sobre la existencia de neurogénesis en la zona subgranular, en la capa celular granular en el hilio del adulto. El promedio de la fracción de células marcadas por BrdU que también eran calbidina-positivas en la capa celular granular fue de 7.9 ± 2.2% en los pacientes tratados con BrdU. En el girus dentado de todos los individuos contenían una fracción de células BrdU-positivas que también eran GFAP-positivas, 18.1 ± 1.8%, y tenían la típica morfología con forma de estrella de las células gliales con nucleos pequeños e irregulares y cuerpos celulares pequeños con delgados procesos GFAP-positivos (Fig. 4c-d). El girus dentado de todos los sujetos contenía células BrdU-positivas que fueron inmunonegativas para ambos marcadores, neuronal y glial. Estas células inmunone-gativas probablemente representan células indiferenciadas aquiescentes, células nuevas de un fenotipo no examinado aquí y/o un pool de células progenitoras dividiéndose asimétricamente. Estas células se caracterizaban por poseer núcleos BrdU-positivos pequeños, redondos a ovales y carecer de inmunoreactividad celular específica.

Para confirmar la presencia de neurogénesis, nosotros marcamos doblemente utilizando anticuerpos contra BrdU y NSE, calbidina o NeuN con cromógenos para ópticas de luz brillante (fosfatasa alcalina (Vector Blue) para BrdU y 3-amino-9- etilcarbazol (AEC) para los marcadores neuronales). Si bien no se pudo utilizar microscopía confocal para obtener imágenes, los cromógenos de campo brillante tenían la ventaja de no palidecer con el tiempo de análisis y de no contribuir con autofluorescencia a la imagen. La examinación de las tinciones de campo brillante en el hipocampo humano adulto confirmaron que las células BrdU-positivas podían co-expresar un fenotipo neuronal (Fig. 5a-e) morfológicamente indistinguible de las neuronas BrdU-positivas del roedor adulto (Fig.5f y g), avalando fuertemente nuestra conclusión de que la neurogénesis ocurre en la capa celular granular dentada en el cerebro humano adulto.

 

La marcación con BrdU en la zona subventricular del cerebro humano adulto

Otra región neurogénica, la zona subventricular (SVZ) adjacente al núcleo caudado, fue examinada en búsqueda de la presencia de células BrdU-positivas. Muestras de tejido de todos los pacientes tratados con BrdU contenían células BrdU positivas dentro de SVZ (Fig. 1e-f). Las células BrdU-positivas no co-expresaban los marcadores celulares específicos GFAP ni NeuN (datos no mostrados). La morfología de los núcleos marcados con BrdU, dentro de SVZ, era de formas pequeñas y redondas a ovales, parecidas a la de las células progenitoras en la SVZ de la rata (ref. 5). Estos hallazgos apoyan la idea de que la SVZ humana contiene células progenitoras y que se requiere que estas células migren desde la SVZ antes de diferenciarse 22. Nosotros no pudimos detectar ninguna célula BrdU-inmunoreactiva en el tejido proveniente del paciente control quien no había recibido el tratamiento con BrdU, avalando la interpretación de que la tinción con BrdU que nosotros reportamos aquí refleja la persistencia de génesis celular en el cerebro humano adulto.

 

Discusión

Nuestros estudios demostraron que la génesis celular ocurre en el cerebro humano y que el cerebro humano retiene el potencial de autorenovarse a través de toda la vida. Si bien estudios anteriores realizados en primates adultos no han sido exitosos en mostrar neurogénesis en el girus dentado 23,24, un reporte reciente ha demostrado neurogénesis en monos marmoset de tres años de edad 6. Aún cuando el número de células BrdU-positivas que entran al linaje neuronal parece ser menor en el hipocampo humano que en el de los marmosets, aquellos monos 6 eran considerablemente más jóvenes, inclusive en términos relativos, que los humanos examinados aquí (edad promedio de 64.4 ± 2.9 años). Por ello, nosotros concluímos que, como en los roedores 5,25, la neurogénesis en el girus dentado humano continúa a través de toda su vida.

Si bien nuestros resultados demostraron que las células en el cerebro adulto experimentan división celular y que algunas de las recientes células generadas pueden sobrevivir y diferenciarse a neuronas, nosotros no hemos comprobado que estas nuevas células sean funcionales.

Nosotros tampoco sabemos todavía el significado biológico de la génesis celular en el cerebro humano adulto. Sin embargo, esto provee las bases para investigar un nuevo tipo recién descubierto de "neuroplasticidad" en humanos, uno basado en el agregado de neuronas, que no ha sido considerado anteriormente. Estudios en roedores han demostrado que células progenitoras del hipocampo adulto que pueden ser expandidas in vitro e injertadas nuevamente en el cerebro adulto, donde ellas pueden responder a indicaciones regionales para diferenciarse en fenotipos sitio-específicos, incluyendo neuronas 26,27 . La presencia de células progenitoras en el girus dentado, informada aquí, indica que estas células también podrían ser usadas en estudios in vitro e in vivo de diferenciación celular y posiblemente en estudios de subsecuentes trasplantes. Más aún, estimulaciones del medio ambiente pueden influenciar la velocidad de la neurogénesis en el girus dentado de roedores adultos y senescentes 12,17 . El potencial de regular la neurogénesis humana debería demostrar que es un área interesante de investigación.

 

Métodos

Material de autopsia. El tejido del hipocampo humano fue obtenido en la autopsia con el total consentimiento de cada familia. Todos los pacientes fueron diagnosticados con carcinoma de células escamosas en la base de la lengua, en la laringe o en la faringe. Todos los pacientes recibieron bromodeoxiuridina (BrdU) (250 mg) disuelta en solución salina y dada como una infusión intravenosa (2.5 mg/ml, 100 ml). La BrdU fue suministrada a los pacientes para calcular la actividad proliferativa de las células tumorales, expresada como indicación de marcación por BrdU. No se encontró señal macroscópica o microscópica de metástasis en el material de la auptosia del cerebro de ninguno de los pacientes. No se suministró ninguna terapia anticáncer antes o durante la administración de BrdU a ninguno de los pacientes.

Preparación del tejido. El hipocampo y la zona ventricular fueron removidos y fijados en formaldehído 4% por 24 hs y luego transferidos a una solución de sucrosa 30% hasta llegar al equilibrio. Los hipocampos fueron seccionados (cortes de 40um de grosor) en el plano coronal en un micrótomo y guardados a -20 ° C en un buffer crioprotector conteniendo 25% etilenglicol, 25% glicerina y 0.05 M buffer fosfato. Secciones derivadas de ratas y ratones adultos inyectados con BrdU que habían sido perfundidos intracardialmente con 4% paraformaldehído fueron procesadas en paralelo con el tejido humano para su comparación.

Histología. La detección inmunohistoquímica de BrdU requiere un pretratamiento de la secciones para desnaturalizar el ADN (ref. 5). Todas las tinciones fueron realizadas en secciones flotantes y el buffer de bloqueo contenía 3% suero normal de asno y 3% suero normal humano (Sigma). En las secciones con solo tinción de BrdU se utilizó un anticuerpo de ratón contra BrdU (Boehringer; diluído 1:400) en combinación con el método del complejo avidina-biotina con un anticuerpo biotinilado de asno contra IgG de ratón (Vector Laboratories, Burlingame, California; diluído 1:167) y revelado con el cromógeno diaminobenzidina (DAB).

La doble y triple inmunomarcación se realizó como está descripto 5,12 . En la inmunotinción múltiple la BrdU fue detectada con un anticuerpo de rata contra BrdU (Harlan Sera-Lab, Loughborough, England; diluted 1:500) y visualizada con un anticuerpo secundario de asno contra anticuerpos de rata conjugado a FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania; diluted 1:250). Para los marcadores fenotípicos neuronales las secciones fueron incubadas con uno de los siguientes antisueros: antisuero de conejo contra calbidina (SWant, Bellizona, Swuitzerland; diluído 1:1000), o antisuero de ratón contra NeuN (from R. Mullen 18 ; diluído 1:20), o antisuero de conejo contra NSE (Polysciences, Warrington, Pennsylvania; diluted 1:800). Estos marcadores neuronales fueron visualizados utilizando el anticuerpo secundario de la especie apropiada conjugado a Cy3 (Jackson ImmunoReserach, West Grove, Pennsylvanis; diluído 1:250). La detección de la GFAP se realizó en las mismas secciones utilizando un anticuerpo de cobayo contra GFAP (Advanced Immunochemicals, Long Beach, California; diluído 1:250) y visualizado por un anticuerpo de asno contra anticuerpos de cobayo conjugado a Cy5 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania; diluted 1:250).

En el caso de la doble inmunomarcación con cromógenos de campo brillante, las secciones fueron incubadas con un solución mezcla de anticuerpos de rata contra BrdU (Harlan Sera-Lab, Loughborough, England; diluted 1:500) y de ratón contra NeuN (from R. Mullen 18 ; diluído 1:100). Después del lavado y el bloqueo, las secciones fueron incubadas primero con un anticuerpo biotinilado de asno contra anticuerpos de rata (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania; diluted 1:250), seguido de una incubación con el sustrato avidina-biotina fosfatasa alcalina y luego revelado con el cromógeno azul (Vector Blue; Vector Laboratories, Burlingame, California). Después de otro lavado y otro bloqueo, las secciones fueron incubadas con un anticuerpo biotinilado de asno contra anticuerpos de ratón (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania; diluted 1:250) seguido de una incubación con un sustrato avidina-biotina peroxidasa y revelado con el cromógeno rojo (3-amino-9-etilcarbazole o AEC; Vector Laboratories, Burlingame, California). Las secciones fueron montadas y cubiertas con cubreobjetos en una solución acuosa de montaje.

Las señales fluorescentes fueron tomadas con un microscopio confocal láser de barrido equipado con láser de gases criptón/argón (Bio-Rad MRC1024; Bio-Rad, Richmond, California) utilizando una colección de longitudes de onda individuales para minimizar la detección artificial causada por emisión fluorescente no específica. Por lo menos 20 células BrdU-positivas fueron examinadas por microscopía confocal en las secciones teñidas con múltiple inmunofluorescentes en cada paciente para determinar el fenotipo de las células marcadas con BrdU. Imágenes de campo brillante fueron derivadas de fotomicrografías digitalizadas convencionales mediante el uso de escáners de portaobjetos. Las figuras fueron armadas con Adobe Photoshop (Adobe Systems, Mountain View, California) con ajustes de imagen delimitados para crear una señal de distribución equivalente entre los paneles.

Cuantificación. El número de células BrdU-positivas en la capa celular granular, en la capa subgranular y en el hilio, y sus correspondientes volúmenes de muestra fueron determinados en cinco a siete secciones coronales teñidas con inmunoperoxidasa, de 40um de grosor, por lo menos separadas 240um, en cada paciente. Las estimaciones de las áreas fueron hechas en un sistema de análisis de imágenes IBAS. El grosor de 40um (posición del micrótomo) de las secciones fue utilizada para la estimación del volumen. El número de células BrdU-positivas fue contado dentro de la capa celular granular (GCL) y dos células en diámetro por debajo de la capa celular granulosa, ignorando las células en el plano focal superior y enfocando a través del grosor de la sección (principio óptico disector, refs. 14,15,16) para evitar errores de sobremuestreo. La zona subgranular (SGZ) fue definida como el área desde el diámetro de una célula dentro de GCL al borde entre el hilio y GCL y hasta el diámetro de dos células por debajo del borde entre el hilio y GCL (Fig.1). El análisis cuantitativo de las secciones con BrdU teñidas con inmunoperoxidasa fueron realizadas con un microscopio Nikon equipado con una videocámara. Los resultados están expresados como células BrdU-positivas por volúmen de la muestra por sección.

 

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FIGURAS

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Fig. 1 Células generadas recientemente pueden ser detectadas en el cerebro humano adulto en pacientes previamente tratados con BrdU. a, La región del hipocampo del cerebro humano adulto con tinción de inmuno-peroxidasa para el marcador neuronal NeuN. b, La capa celular granular (GCL) del girus dentado del hipocampo visualizada con tinción de inmunoperoxidasa para NeuN. c, Microfotografía de contraste diferencial de interferencia que muestra núcleos marcados con BrdU (flechas) en la GCL dentada humana. Los núcleos BrdU-positivos tienen apariencia redondeada y semejan la estructura de cromatina de las células granulares maduras y se encuentran dentro de la capa de células granulares. e, Microfotogra-fía de contraste diferencial de interferencia que muestra células BrdU-positivas (flechas) adjacentes a la membrana ependimal en la zona subventricular del núcleo caudado humano. En la zona subventricular de la rata (SVZ) se encuentran células con núcleos elongados que semejan células en migración. f, Microfotografía de contraste diferencial de interferencia que muestra células BrdU-positivas (flechas) con núcleos elongados en la zona subventricular del núcleo caudado humano. Todas las barras de escala representan 50um.

 

 

 

Fig. 2 Cuantificación de células generadas recientemente en el hipocampo adulto humano. La densidad de las células con tinción de inmunoperoxidasa para BrdU en la zona subgranular (SCG) (a) y en la capa celular granular (GCL) (b) y en el hilio (c) fue determinada en cinco a siete secciones por paciente (número promedio de células BrdU-positivas por mm 3 de muestra ± d.s.) Se informa la edad de los pacientes al morir y el intervalo de infusiones con BrdU para cada paciente tratado (n=5).

 

Fig. 3 Las células generadas recientemente en el girus dentado del adulto humano pueden expresar fenotipo neuronal. Detección simultánea de marcación inmunofluorescente para NeuN (a; la barra de escala representa 25 um), BrdU (b) y GFAP (c) para la detección de astrocitos y un registro de la unión de estas señales en x-, y- y z- (d) examinadas por microscopía confocal mostraron que los núcleos marcados con BrdU podían específicamente co-expresar NeuN sin expresar GFAP (flechas en a-d). Además de la marcación específica con BrdU, algunas neuronas contenían fluorescencia no específica en la emisión verde y roja, reflejando su acumulación de gránulos de lipofucsina (cabeza de flechas en a-d). Células rojas de la sangre, presentes en varios vasos sanguíneos pequeños, tambien emiten fluorescencia verde y roja no específica (los vasos sanguíneos pequeños se indican por cabezas de flecha y vasos sanguíneos más grandes son indicados por asteriscos en e-h). La especificidad de la co-expresión BrdU-NeuN en tres dimensiones se demuestra por una serie de planos focales sobre (e,f) y debajo (g,h) del plano focal mostrado en d ( las flechas indican la misma célula que en d). La apariencia de las neuronas BrdU-positivas adultas en la cinrcunvolución dentada humana es equivalente a las neuronas marcadas con BrdU en el girus dentado de la rata (i-l; la barra de la escala representa 25um). El tejido de rata (i-l) está a diferente magnificación que el tejido humano (a-h).