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Miguel A. Reigosa*
Abel N. Rodríguez*

Los cultivos de tejidos animales aislados representan uno de los campos más fascinantes de la biología. Constituyen una herramienta usual para elaborar modelos experimentales y como sustratos para la propagación de virus, entre otras aplicaciones importantes.

Qué es un cultivo de tejido?. La palabra cultivo deriva de la voz latina cultura (labrar, cultivar), y tejido proviene del latín texere (tejer, tramar). Desde el punto de vista histológico, denota una asociación integrada de células, siendo el conjunto una entidad reconocida con arquitectura totalmente definida.

En 1964, S. Fedoroff propuso definir el cultivo de tejido como ”el estudio de células, tejidos y órganos, obtenidos de animales y mantenidos desarrollándose in vitro durante más de veinticuatro horas”. Quizá sea más apropiado denominar a esas técnicas cultivos celulares, porque en realidad se trata de poblaciones celulares derivadas de la desagregación de tejidos.

En sus comienzos, los cultivos celulares, consistieron en bioensayos, realizados para estudiar la diferenciación celular, o mecanismos embriológicos, o simple-mente para demostraciones de tipo académico. Hoy, en cambio, se han convertido en la base fundamental para resolver numerosos problemas biológi-cos de suma importancia.

Ya en el siglo pasado, los biólogos se habían percatado de que la muerte de un organismo cualquiera no significaba la muerte simultánea de todas sus partes. Y, aprovechando esta característica, Claude Bernard ( 1878) suministró las bases teóricas para crear un sistema artificial en el que las células o tejidos pudieran sobrevivir independientemente del organismo de que fueran extraídos.

En 1866, F.D. Von Recklinghausen dio los primeros pasos en esa dirección al colocar en diversas condiciones células sanguíneas de anfibios, logrando conservar su viabilidad por más de treinta días.

Pero el primer experimento importante fue efectuado por Wilhelm Roux en (1885), en embriología experimental, al lograr el aislamiento de una placa neural de embrión de pollo manteniéndola viva en una solución salina. Este bioensayo lo realizó con el objeto de estudiar el desarrollo de dicha placa in vitro, y demostrar que el cierre de la misma se debía a la multiplicación de sus células y no a la compresión ejercida por las estructuras adyacentes, como sostenían otros investigadores.

Dos años más tarde, Arnold analizó la supervivencia de leucocitos de rana en solución fisiológica. Pequeños fragmen-tos de esponja vegetal fueron colocados bajo la piel de estos anfibios, donde prontamente los invadían células blancas. Luego, estos fragmentos fueron introducidos en solución fisiológica. Arnold pudo observar entonces cómo los leucocitos migraban y sobrevivían durante algún tiempo, demostrando de esta manera la individualidad e independencia de estas células.

El primer cultivo celular verdadero en sentido moderno fue realizado por Ross Harrison en 1907, y permitió dilucidar la controversia suscitada entre el anatomista alemán Hensen, quien sostenía que las terminaciones nerviosas se originaban en la lámina basal, y los neurólogos Ramón y Cajal y His, quienes opinaban que lo hacían a partir del cuerpo neuronal. El experimento de Harrison consistió en lo siguiente: aisló trozos de pared del tubo neural de un embrión de rana y los mantuvo en un coágulo linfático de un animal adulto, observando que las células crecían durante varios días y se iban diferenciando hasta formar fibras nerviosas. Estos estudios de neurogéne-sis coincidieron con la hipótesis de Ramón y Cajal y His, al demostrar que las fibras sólo se forman a partir de las neuronas, y no por la influencia de los tejidos circundantes.

Después, dos años más tarde, Harrison y uno de sus discípulos, Burrows, tuvieron la idea de incorporar plasma sanguíneo a los cultivos de embrión de pollo, lo que les permitió cultivar sobre cubreobjetos células en coágulo de plasma homólogo. Burrows fue el primero en observar y describir la mitosis en células in vitro, y también fue él quien acuñó la denominación de ”cultivo de tejido”.

Fue otro discípulo de Harrison el que hizo avanzar a pasos de gigante los cultivos celulares. Se trata de María José Augusto Carrel, nacido en Lyon, Francia, en 1873, y cuya vida, caracterizada por sus aciertos científicos y por las circunstancias que los determinaron, merece que se le dediquen algunos párrafos especiales en este artículo.

Carrel fue hijo, por extraña coincidencia, de un fabricante de tejidos. Perdió a su padre tempranamente, y el nombre Alexis con que se le conoce fue adoptado por él en homenaje a su progenitor. Su interés por las Ciencias Naturales se despertó desde su temprana juventud -según dice uno de sus biógrafos- constituyendo uno de sus pasatiempos la disección de pájaros que encontraba en los parques y la observación de la vida animal.

Al concluir su bachillerato, ingresa en la Facultad de Medicina donde se destaca prontamente por su habilidad en las técnicas quirúrgicas, cualidad que le valió un alto concepto en la comunidad universitaria y le permitió trabajar en el departamento dirigido por el célebre anatomista Testut.

Carrel obtiene su título de doctor en Medicina con excelentes calificaciones. Se inicia en la profesión en un modesto consultorio, compartido con un amigo. En este tiempo ocurre un hecho fortuito que determinará todo su destino. Una indisposición impedirá a su amigo y colega participar de la peregrinación a Lourdes y le pide a Carrel que lo sustituya. El grupo de peregrinos incluía a una niña que padecía peritonitis tuberculosa, diagnóstico que fue confir-mado por el propio Carrel. La niña se cura durante la gira y este episodio, atribuido a un milagro, es atestiguado por Carrel, quien, pese a contraponerse a sus convicciones científicas, firma el libro de comprobaciones médicas a modo de testimonio.

El episodio ejerció un efecto negativo sobre su carrera profesional, inducién-dole a emigrar a Canadá, donde reanuda su carrera científica. En el curso de los viajes que realiza a Estados Unidos para dictar clases y conferencias, establece contactos con las autoridades del incipiente Instituto Rochefeller, donde finalmente ingresa y permanecerá durante treinta años, obteniendo sus mejores logros científicos en cultivos celulares.

Alexis Carrel introdujo las técnicas más novedosas, incorporando el extracto de embrión de pollo como estimulador del crecimiento celular, sustancia, cuyo uso, se hizo universal. Ideó, además, instrumentos especiales e inventó recipientes que llevan su nombre. Este ”creador de técnicas”, como él mismo, a veces, se denominaba, recibió el premio Nobel de Medicina en 1912, siendo el más joven de los sabios laureados hasta ese momento.

Su espíritu innovador jamás descan-saba. Intentó obtener vacunas utilizando células como sustrato de virus, junto con su colaborador Rivers. Con Charles Linbergh, el célebre aviador que efectuó el cruce aéreo del Océano Atlántico, construyó un corazón artificial y también otros aparatos usados como auxiliares en la cirugía moderna.

Otro mérito de Carrel fue haber conservado viva durante treinta años una línea celular de corazón de pollo. Este ensayo fue muy criticado por la comunidad científica; pues Carrel utilizaba como nutriente extracto embrionario, que presumiblemente poseía células frescas que se multiplicarían hasta reemplazar totalmente al cultivo original, con lo cual era posible que la “inmortalidad” se debiera a este reemplazo. Quizá no se le ocurrió a Carrel pensar en esta posibilidad.

Una de las causas por la cual las revolucionarias técnicas de cultivos celulares de Carrel no alcanzaron mayor difusión radicaba en el elevado costo de su reproducción, por lo que su aplicación quedó durante un tiempo confinada a reducidos grupos de investigadores que disponían de mayores posibilidades económicas.

El aspecto nutritivo de los cultivos fue estudiado al mismo tiempo que Carrel por Warren y Margaret Lewis (1911), quienes realizaron una cuidadosa investigación de los efectos ejercidos por sales, aminoácidos, carbohidratos y otros compuestos sobre el desarrollo a corto plazo de células animales in vitro. Este enfoque, aunque produjo menos resultados espectaculares inmediatos en términos de prolongación del crecimiento y de diferencias observables en el modelo de desarrollo, fue, en teoría, más útil para llegar a comprender los procesos fisiológicos implicados. Los trabajos de Lewis y Lewis constituyeron, el punto de partida para la elaboración de los llamados ”medios sintéticos”, que se utilizan actualmente en los cultivos celulares. En general, están compuestos a partir de sales minerales, aminoácidos y vitaminas, y esta composición varía de acuerdo a los diferentes tipos y requerimientos de las células empleadas.

Estos trabajos, fueron continuados y ampliados por Fischer (1939), White (1946), Morgan, Morton y Parker (1950), quienes introdujeron el ampliamente difundido medio de cultivo 199. Paralelamente, Eagle (1955) investigó las necesidades nutricias de las células de mamífero, desarrollando el medio que lleva su nombre.

Otro progreso en los cultivos celulares consistió en la obtención de la primera línea celular establecida, también llamada línea celular continua, consistente en células adaptadas a un crecimiento indefinido en medio de cultivo, debida a Wilton R. Earle en 1940. Esta línea derivó de un cultivo de fibroblastos de tejido conjuntivo de ratón. Años más tarde, la gran contribución la realizó George O. Gey, al desarrollar la primera línea celular establecida de células humanas (Véase el recuadro ”Células con historia”), a partir de un carcinoma cervical. La adquisición de la capacidad para proliferar indefinida-mente en medio de cultivo representa una considerable ventaja para el investigador, pues permite la repetición de los bioensayos, al poder contar con células idénticas en forma permanente.

Asimismo, Gey demostró los efectos estimuladores de una hormona (insulina) sobre el crecimiento en cultivos de fibroblastos.

Es probable que hayan sido estas las que orientaron a Rita Levi Montalcini hacia su trabajo sobre el factor de crecimiento nervioso, que activa la génesis del axón in vitro, descubrimiento que le valió el premio Nobel en 1954.

Otro progreso fundamental fue la obtención de clones celulares a partir de una sola célula, trabajo realizado por primera vez por K. K. Sanford (1948) cuando formaba parte del equipo del Dr. Earle. Por medio de una técnica tediosa, empleando capilares de vidrio, logró aislar células individuales, que luego proliferaban formando cada una de ellas una cepa particular. Más tarde, este método fue reemplazado por otros como los desarrollados por A. Lwoff y R. Dulbecco.

Otro de los hitos fundamentales en el avance y generalización de las técnicas de cultivo, fue efectuado por A. Moscona (1952), usando la enzima proteolítica tripsina en la disociación de células.

La década del 40 marcó la diversificación y difusión de los cultivos celulares, como también sus aplicaciones en diversos campos de la Biología, la Medicina y la Bioquímica. Es justamente durante esta década que hacen su ingreso a nuestro país de la mano de la Dra. E. Sacerdote de Lustig, (Véase recuadro ”Los Cultivos Celulares en Argentina”) para instalarse definitivamente aquí.

El descubrimiento de los antibióticos y su incorporación en los cultivos celulares, permitió la simplificación de numerosas técnicas. Ahora las células podían ser cultivadas durante lapsos más prolongados en condiciones de rigurosa asepsia, pues las contaminaciones bacterianas y fúngicas hasta entonces constituían los principales enemigos de los cultivos.

A partir de 1956 comenzaron a prepararse vacunas virales gracias a las técnicas de cultivos celulares, evitándo-se de esta manera el sacrificio de animales para la producción y diagnóstico viral.

Durante la década del 60 se destacaron las investigaciones de L. Hayflick y P.S. Moorhead, orientadas a establecer la correspondencia existente entre la vida media de un organismo vivo y la de sus células in vitro. Estos autores comprobaron que células humanas, en condiciones de cultivo, sólo llegaban a duplicar su población unas setenta veces, y luego iban perdiendo su capacidad de división y se extinguían. Al extender sus investigaciones a otras especies animales, comprobaron que la potencialidad de crecimiento in vitro de células de vertebrados era directamente proporcional a sus respectivos lapsos de vida media. Por ejemplo, células de tortugas de las Islas Galápagos superaron las doscientas duplicaciones en cultivo.

En 1965, Harris y Watkins produjeron los primeros híbridos de células de mamífero, fusionando víricamente células humanas y de ratón, años después en 1975, Georges Kohler fue como becario al laboratorio de César Milstein en Cambridge y con los aportes de J.C. Howard y G. Buscher, logran los anticuerpos monoclonales. Por este hallazgo recibieron el premio Nobel de Medicina en 1984. Dice Milstein: ”Si el objetivo de mi investigación cinco o seis años atrás hubiese sido la producción de anticuerpos monoclonales, no se me hubiera podido ocurrir intentar simultá-neamente obtener mutantes de células secretoras de anticuerpos en un rincón del laboratorio y la fusión de dos células sanguíneas en otro, pero ésa había de ser la combinación que condujo a la producción de anticuerpos monoclona-les”.

Un año después G. Sato y colaboradores publican el primero de una serie de trabajos demostrando que para crecer células en un medio de cultivo sin suero, las líneas celulares requieren mezclas diferentes de hormonas y de factores de crecimiento. Este investigador ya era un destacado en cultivos celulares, años atrás conjuntamente con Augusti establecieron líneas de células nerviosas tumorales de ratón (neuroblastoma) y aislaron clones que eran excitables eléctricamente y producían prolongacio-nes nerviosas.

Los comienzos de la década del ochenta se caracterizaron por el desarrollo de técnicas tendientes a la incorporación de genes dentro del genoma celular. Wingler y Axel presentaron métodos para introducir genes humanos de copia única en el núcleo de células cultivadas, adaptando las técnicas desarrolladas inicialmente por Graham y van der Eb.

En 1991, Sasaki y colaboradores consignaron introducir genes en una línea de células murinas, por congelación rápida en nitrógeno líquido. Los cristales de hielo intracelulares formados produjeron fracturas en la membrana de las células permitiendo la penetración de los genes. Este método se diferencia de la electroporación por ser rápido, sencillo y práctico, además de no necesitar de equipos especiales.

Las técnicas de control de calidad de las células en cultivo, publicadas en 1992 por la American Type Culture Association describen la formación del banco de células de la ATCC, las cuales han servido de modelo para la creación de muchos otros en distintas partes del mundo. En 1996, R. J. Hay -directivo de ATCC- señaló la necesidad de bancos de líneas celulares centralizados, y en una publicación dio una lista de los existentes y de los que están en desarrollo. Nos enorgullece que, en esa lista, aparezca la Asociación Banco Argentino de Células (ABAC) Institución generada por una iniciativa del III Congreso de Virología celebrado en Córdoba (1986). Con el esfuerzo de investigadores, científicos y técnicos, la ABAC lleva 13 años brindando servicios y asesoramiento a quienes utilizamos células ”in vitro” con fines básicos y aplicados.

Uno de los últimos logros científicos alcanzados y de gran divulgación ha sido la clonación de un mamífero por Wilmut I, Schnieke A. y colaboradores. La oveja Dolly constituyó el gran hito biológico de finales de siglo. El mismo produjo comentarios y discusiones desde todos los ámbitos: científicos, sociales y hasta religiosos.

El cultivo de células mamarias fue decisivo para lograr los resultados conocidos. Una vez más los cultivos de células animales se transformaban en una herramienta fundamental para los  avances de la Ciencia.

Hasta aquí hemos efectuado un breve recorrido por las principales investigaciones realizadas en el campo de los cultivos celulares animales. La historia de esta disciplina nos permite formarnos una idea de la importancia decisiva que tuvo en dominios teóricos y aplicados pertenecientes a distintas áreas científicas. Y también, vislumbrar que contribuirá decisivamente a resolver en el futuro diversos interrogantes relacionados con el misterio de la vida.

Lecturas Sugeridas.

-Adams, R.L.P., Elsevier Science Publishers. Amsterdam, The Netherlands, 1990. Cell Culture For Biochemists. Laboratory Techniques in Biochemistry and Biology. 2nd. Ed. 364 pp.

-Parker, R.C. Paul B. Hoeber, Inc. Medical Div. of Harper & Brothers. 1961. 3rd. Ed. Methods of Tissue Culture.

-Paul, John. Churchill Livingstone.1975. Cell and Tissue Culture.

-Kruse, P.F. Jr. & Patterson, M.K. Jr. Academic Press. New York. London. 1973. Tissue Culture Methods and Applications.

-Laura Rozenber. ”Eugenia Sacerdote de Lustig. Una pionera de la ciencia en la Argentina”. Asoc. Dante Alighieri. Tucumán 1646. Bs. As. 1992.

Agradecimientos

Al doctor Ovidio Núñez, por la corrección del manuscrito.

*IMBICE. (CIC-CONICET).CC 403 (1900). La Plata. Argentina. Imbice@netverk.com.ar / imbice@satlink.com

Fax. 54-21-253320 / Tel.(021) 210112.

**Lab. Central de Salud Pública de la Prov. Bs. As.